MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human Kappa Light Chains/FITC
Anti-Human Lambda Light Chains/RPE
Anti-Human CD19/RPE-Cy5
Kod nr. TC051
Avsedd användning
För diagnostisk användning in vitro.
TC051 är avsedd för användning inom flödescytometri för simultan detektering och beräkning av kappa light
chains och lambda light chains på humana B-celler. I flödescytometri är antikroppar till kappa light chains
användbara för att påvisa kappa light chains på cellytan och antikroppar till lambda light chains för att påvisa
lambda light chains på cellytan och således för identifiering av monoklonalitet (klonalt överskott) i B-cells
lymfoproliferativa sjukdomar tillsammans med en panel av andra antikroppar (1-4). CD19 är den bredaste
utvecklingsspecifika ytmarkören för B-celler och den finns närvarande på ytan hos praktiskt taget alla Blymfocyter, inklusive tidiga B-progenitorceller (5). CD19-uttrycket bibehålls i B-utvecklingsceller som har
genomgått neoplastisk transformation (6). Antikroppar till CD19 anses väsentliga för den initiala utvärderingen
av akuta och kroniska lymfoproliferativa sjukdomar (7). Tolkning måste göras av kvalificerad specialist inom
ramen för patientens anamnes och andra diagnostiska tester.
Ingående reagenser
TC051 består av de följande tre, noggrant matchade fluorescenta antikroppar:
Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains konjugerade med FITC (fluorescein isotiocyanatisomer 1).
Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains, konjugerad med RPE (R-phycoerythrin).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD19, klon HD37, konjugerad med RPE-Cy5 (R-phycoerythrin-Cyanine 5).
Anti-Kappa Light Chains-konjugaten har producerats av F(ab')2-fragment av affinitetsisolerad polyklonal
kaninantikropp. Anti-Lambda Light Chains-konjugaten har producerats av F(ab')2-fragment av affinitetsisolerad
polyklonal kaninantikropp. Anti-CD19-konjugatet har producerats från renad monoklonal musantikropp.
TC051 levereras i vätskeform i en buffert innehållande 1% bovinserumalbumin (BSA) och 15 mmol/L NaN 3, pH
7,2. Varje flaska innehåller 50 tester (10 µL konjugat för upp till 10 6 leukocyter från normalt humant perifert
blod).
Immunogener
Antikroppskod nr.
Fluorokrom
Kontroll reagens
kod nr.
TC051
FITC, RPE och RPE-Cy5
X0957
Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains: Polyklonala immunoglobulin light chains av kappa-typ isolerade från en
pool av human sera.
Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains: Polyklonala immunoglobulin light chains av lambdatyp isolerade från en
pool av humana sera.
Anti-CD19, klon HD37: Hårcellsleukemiceller.
Specificitet
Anti-Kappa Light Chains: Reagerar med fria kappa chains såväl som kappa chains i intakta
immunoglobulinmolekyler. Specificiteten har fastställts enligt beskrivning nedan. För att erhålla maximal sensitivitet
utfördes specificitetstestet crossed immunoelektrofores, före affinitetsreningen och pepsinnedbrytningen.
Crossed immunoelectrophoresis: Endast kappa-relaterade precipitat framträder när antikroppen körs mot
humanplasma. Färgning: Coomassie Brilliant Blue.
Flödescytometri: När anti-Kappa light chains/FITC används, som beskrivits i färgningsproceduren i kombination
med Anti-CD19/RPE, HD37, på lyserat humant helblod, syns en specifik färgning av en del av de CD19-positiva Blymfocyterna motsvarande det förväntade intervallet av kappa light chain-uttryck.
Anti-Lambda Light Chains: Reagerar med såväl fria lambda-kedjor som lambda-kedjor i intakta
immunoglobulinmolekyler. Specificiteten har fastställts enligt beskrivning nedan. För att erhålla maximal sensitivitet
utfördes specificitetstestet crossed immunoelektrofores, före affinitetsreningen och pepsinnedbrytningen.
Crossed immunoelectrophoresis: Endast lambda-relaterade precipitat framträder när antikroppen körs mot
humanplasma. Färgning: Coomassie Brilliant Blue.
Flödescytometri: När anti-lambda light chains används, som beskrivits i färgningsproceduren i kombination med
Anti-CD19/FITC, HD37, på lyserat humant helblod, syns en specifik färgning av en del av de CD19-positiva Blymfocyterna motsvarande det förväntade intervallet av lambda light chain-uttryck.
Flödescytometrisk analys av enskilda suspensioner från formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsprover visade
att anti-lambda light chains märker reaktiva hyperplastiska lymfnoder, vilket också är fallet för anti-kappa light
chains (10/10 fall). Vid icke-Hodgkins lymfom märkte antikroppen 5/10 fall. De återstående fallen var positiva för
kappa light chains (4/10 fall) eller visade inte något uttryck av light chains (1/10 fall) (4).
Flödescytometrisk analys av perifera blodlymfocyter visade att anti-kappa light chains respektive anti-lambda light
chains märker en andel av B-cells kroniska lymfocytiska leukemier. Sålunda, i en studie av 121 fall (2) var 37
positiva för kappa och 17 positiva för lambda. I en annan studie av 165 fall (3) var 97 positiva för kappa och 68
positiva för lambda.
Anti-CD19, HD37: Ingick i den Second, Third, Fourth and Fifth International Workshops and Conferences on
Human Leucocyte Differentiation Antigens och studier utförda av ett antal laboratorier bekräftade dess reaktivitet
(105360-003)
TC051/SE/MTH/09.03.05 s. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
med CD19 (8). Anti-CD19, HD37 färgar humana B-celler i perifert blod, benmärg och annan vävnad. Dessutom gav
B-cellslymfoproliferativa sjukdomar positiva reaktioner med antikroppen, dvs. akut lymfoblastisk leukemi, kronisk
lymfocytisk leukemi, hårcellsleukemi, lymfoblastiskt lymfom (typ Burkitt), centroblastisk/centrocytisk lymfom och
diffust non-Hodgkins lymfom. Antikroppen har visats vara oreaktiv med andra celler i det humana hematopoetiska
systemet och reagerade inte med icke-hematopoetiska celler, t.ex. i njure, lever, bröst- eller lungvävnader (8).
TC051, Flödescytometri: När TC051 appliceras så som beskrivs i färgningsproceduren på lyserat humant helblod
syns en specifik färgning av en del av de CD19-positiva B-cellslymfocyterna inom det förväntade intervallet för
kappa och lambda light chain uttrycket.
Anvisningar och
försiktighetsåtgärder
1. För professionella användare.
2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN3), en kemikalie som är synnerligen toxisk i ren form. I
produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och
kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det slås bort för att
förhindra att metallazider byggs upp i avloppet.
3. Som med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta procedurer användas vid
hanteringen.
Förvaring
Förvaras mörkt vid 2-8 oC. Använd inte efter utgångsdatum som är angivet på flaskan. Om reagenserna
förvaras i annan miljö än de specificerade, måste förhållandena verifieras av användaren. Det finns inga tydliga
tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt
med patientprover. Kontakta vår tekniska support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med
variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara något problem med antikroppen.
Produktspecifika
begränsningar
Det har observerats att RPE-Cy5-konjugat kan binda till monocyter och resultera i bakgrundsfärgning (9).
Färgningsprocedur
Före färgning av prover av perifert blod måste de mononukleära cellerna isoleras med centrifugering på ett
separationsmedium eller tvättas för att avlägsna de lösliga serumproteinerna. Eftersom humana monocyter
binder till serumimmunoglobuliner via deras Fc-ytreceptorer bör dessa celler avlägsnas genom tömning eller
identifieras.
1.
Överför 100 µL antikoagulerat (EDTA) blod till ett 12 mm x 75 mm provrör av polystyren.
2.
Tillsätt 2 mL PBS (Dako, kodnr. S3024). Blanda försiktigt med en vortexblandare.
3.
Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar
cirka 50 µL vätska.
4.
Upprepa steg 2 och 3 två gånger till.
5.
Tillsätt 10 µL Rabbit Immunoglobulin Fraction (Dako, kodnr. X0903) för blockering. Blanda försiktigt med
en vortexblandare och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
6.
Tillsätt 10 µL TC051 och blanda försiktigt med en vortexblandare.
7.
Inkubera i mörker vid 2–8 °C i 30 minuter eller vid rumstemperatur (20–25 °C) i 15–30 minuter.
8.
Tillsätt 100 mL Uti-Lyse™ Reagent A (Dako, kodnr. S3325) till varje prov och blanda försiktigt med en
vortexblandare. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
9.
Tillsätt 1 mL Uti-Lyse™ Reagent B (Dako, kodnr. S3325) till varje prov och blanda försiktigt med en
vortexblandare. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
10.
Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar
cirka 50 µL vätska.
11.
Tillsätt 2 mL PBS till varje prov och resuspendera cellerna med en vortexblandare.
12.
Upprepa steg 10.
13.
Resuspendera cellerna i lämplig vätska för flödescytometri, t.ex. 0,3 mL PBS.
14.
Analysera med flödescytometer eller förvara vid 2-8 °C i mörker tills analysen ska utföras. Prover kan
analyseras inom 24 timmar efter färgning.
Observera att fluorokromkonjugater är ljuskänsliga. Proverna bör skyddas från ljus under färgningsproceduren och
tills analysen ska utföras.
Proceduranmärkningar
Steg 1: Det är valfritt att inkludera ett lämpligt positivt och negativt kontrollprov i varje körning för reagens- och
beredningskontroll.
Steg 6: Den rekommenderade konjugatvolymen är endast en riktlinje. Optimala förhållanden kan variera beroende
på prov- och beredningsmetod och bör bestämmas av varje enskilt laboratorium.
Det är valfritt att inkludera ett provrör med kontrollreagens. Kontrollreagenset bör överensstämma med det
konjugerade antikroppsreagenset. Det rekommenderade Triple-Colour Control Reagent för TC051 är Dako kodnr.
X0957.
Steg 8 och 9: Om ett annat cellyseringsreagens används, skall rekommendationerna för detta reagens följas.
Observera att om det alternativa lyseringsreagenset inte innehåller fixativ, t.ex. Dako EasyLyse™, kodnr.
S2364, ska PBS i steg 13 innehålla 1 % paraformaldehyd såvida inte provet analyseras inom samma tidsram
som rekommenderas för lyseringsreagenset.
Steg 14: Onormalt antal celler som uttrycker målantigen eller celler som visar avvikande uttrycksnivåer av antigen
kan förväntas vid vissa sjukdomstillstånd. Detta kan resultera i ett förändrat färgningsmönster. Det är viktigt att
förstå det normala uttrycksmönstret för antigen och dess förhållande till uttryck av andra relevanta antigener för att
utföra lämplig analys.
Flerfärgade reagenser föredras framför enkelfärgade reagenser för den omfattande analysen
flödescytometriprover. Den korrekta användningen av färgersättning är speciellt viktig vid flerfärgsanalys.
(105360-003)
av
TC051/SE/MTH/09.03.05 s. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Referenser
1.
Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and
pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95.
2.
Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell
chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916.
3.
Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic
characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica
1993;78:18-24.
4.
Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of
lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional
diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7.
5.
Pezzutto A, Dörken B, Rabinovitch PS, Ledbetter JA, Moldenhauer G, Clark EA. CD19 monoclonal
antibody HD37 inhibits anti-immunoglobulin-induced B cell activation and proliferation. J Immunol
1987;138:2793-9.
6.
Sato S, Tedder TF. BC3. CD19 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG,
Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan.
New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 133-5.
7.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
8.
Mason DY, Ladyman H, Gatter KC. Immunohistochemical analysis of monoclonal anti-B cell antibodies.
In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the
2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston,
USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 245-55.
9.
van Vugt MJ, van den Herik-Oudijk IE, van de Winkle JGJ. Binding of PE-CY5 conjugates to the human
high-affinity receptor for IgG (CD64). Blood 1996;88:2358-61.
Förklaring av symboler
(105360-003)
Katalognummer
Temperaturbegränsning
Använd före
In vitro diagnostisk medicinsk
apparat
Skydda från solljus
(se förvaringsavsnittet)
Tillverkare
Läs instruktionerna för
användning
Batchkod
TC051/SE/MTH/09.03.05 s. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
