Typning av virulensfaktorer
och lite om MALDI-TOF
Bo Nilson
Klinisk mikrobiologi
Laboratoriemedicin Skåne
Identifiering
• Proteinet
– Ag – ak
•
•
•
•
Agglutination
Elisa
Immunokromatografi
Array
• Nukleinsyra
– DNA
– mRNA
Kliniskt bruk
• Kit
– Oxiod (Denka Seiken)
• TSST-1
• Stafylokock Enterotoxin A, B , C, D
– Denka Seiken
• Exfoliatin A och B (SSSS)
Latexagglutination
• Uppodlade bakterier, 2 dygn
– Anrikning och rening
– Reaktion och avläsning
– Sensitivitet 0,5 – 2 ng/ml
ELISA
• Federal office for civil protection, Spiez
Laboratory, Schweiz
Immunokromatografi
• 9/11 – Bioterrorism
–
–
–
–
Anthrax
Ricin
Botulinumtoxin A, B
SEB
• Sens 15 ng/ml
– Yersinia pestis
– Tularemi
– Brucella
BioThreat Alert®, Tetracore
Nukleinsyradetektion
• PCR
Single- eller multiplex
– Gelelektrofores
– Realtid med smältkurva
– Realtid med specifika prober
– Array
• Fast form
• Beads
• Kromatografiskt
PCR Singleplex + IAC
• Panton-Valentin leukocidin (PVL)
– lukS-lukF
• Nekrotiserande pneumoni (indikator)
• TSST-1
– tst-1
Spa-typning av S. aureus
Sekvensanalys av spa-genen för Protein A
F
S
E
D
A
B
R
C
X
• Repetitiva
segment (RS)
• 1 – 19
• “Unik” sekvens
t690 – 07-12-21-17-13-13-34-34-34-33-34
www.Ridom.de
www.SeqNet.org
Fördelning av SAg gener, agr typer, and eta and etd gener för olika spa-typer
Holtfreter S et al. J. Clin. Microbiol. 2007;45:2669-2680
emm-typning av grupp A streptokocker
Sekvensanalys av emm-genen för M protein
Två isolat har samma emm-typ om deras sekvens är > 95% identiska
F
R
www.cdc.gov
Multiplex – Detektion av många
gener
• Array
– Fast
• Chip
– Beads
• Luminex
– Kromatografisk
• Hain Lifescience m fl
Vad kommer – Nanoteknik
Mishra et al, Lab chip 2008, 8:868-871.
Point-of-care
Gerdes et al, CLI 2008, 5:22-25
En ny, snabb och generell metod för
artbestämning av bakterier och svamp med
masspektrometri
MALDI-TOF
””
””
mass fingerprint
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
ID
Metoder som används för artbestämning idag
Övernattodling av bakterier på agarplattor
Problem:
Snabba metoder
Långtifrån alla prov
Morfologi (makro / mikroskopisk)
dagetc)
1.
Snabbtesterartbestäms
(katalas, oxidas, pasturex
Selektiva och differentierande plattor (chromagar)
Snabbare metoder behövs!
Direkt antibiotika resistens
…
MALDI-TOF
≥ 1 dag
Långsamma metoder
Fenotypiska (API, “Jäsningar”)
Genotypiska (16S sekvensering)
…
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Arbetsflöde MALDI Biotyper
Plocka en koloni
Okänd
mikroorganism
Preparera provet på
MALDI-platta
Identifierad
art
Databas sökning
Automatiserad
spektruminsamling
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Provberedning
MALDI target
Överför celler till
provplattan
MALDI target
Tillsätt matrixlösning (1 µl)
Avdunstning av lösningsmedel
vid rumstemperatur
Matrix:
Automatiserad
MS-analys
UV-absorberande protondonator
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Arbetsflöde MALDI Biotyper
Plocka en koloni
Okänd
Mikroorganism
Preparera prov på
MALDI-platta
Identifierad
art
Databas sökning
30-60 sek
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Automatiserad spektruminsamling 15-30 sek
Principle of MALDI-TOF Mass Spectrometry
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight MS
UV-Laser
+
20 kV
Ion detector
-
Vacuum
Target plate
++
+
Acceleration
Analyte in
matrix crystals
+ + +
+
+
+
Drift
Time-of-Flight
Desorption/
Ionization
UV-Laser
+
+ +
20 kV
Intensity
≈300-500 laser shots
≈15-30 sec. per sample
m/z
Bred tillämpning av MALDI-TOF MS profil
Svamp, jäst, gram+ and gram- bakterier
Aspergillus fumigatus
Candida albicans
Bacillus subtilis
Escherichia coli
3000
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
m/z
Hur fungerar det?
MALDI-TOF profil (rådata)
Pinnspektrum (processad data)
Okänt prov
Stam från
databasen
med känd ID
Det erhållna spektrat konverteras till ett “pinnspektra” och alignas sedan till det
Color
coded
spektra
i referensdatabasen
som matchar bäst.
identification
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
MALDI Biotyper 2.0 – result table
Analyte
Analyte
Organism
Score
Organism
Score
Name
ID
(best match)
Value
(second best match)
Value
BAT09-276
Enterococcus faecium
2,468
Enterococcus faecium
2,466
BB107/09
Enterococcus faecalis
2,431
Enterococcus faecalis
2,319
BAT09-1037
Enterobacter cloacae
2,362
Enterobacter cloacae
2,232
BAT09-1205
Klebsiella pneumoniae
2,408
Klebsiella pneumoniae
2,17
BB2337/09
Clostridium perfringens
2,386
Clostridium perfringens
2,267
BS7547/09
Corynebacterium
diphtheriae
2,15
Corynebacterium
diphtheriae
2,096
BAT09-194
Corynebacterium striatum
2,365
Corynebacterium striatum
2,254
BAT09-1475
Eikenella corrodens
1,937
not reliable identification
1,401
BNL1800/09
Legionella pneumophila
2,367
Legionella pneumophila
1,921
E1
( +++ )
E2
( +++ )
E3
( +++ )
E4
( +++ )
E5
( +++ )
E6
( ++ )
E7
( +++ )
E8
(+)
E9
( +++ )
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Begränsningar
– Vissa närbesläktade arter kan ej särskilja
• Shigella-arter inte i databasen
– Identifieras som E. coli
• Streptococcus pneumonia och S. mitis-gruppen kan inte säkert
separeras.
• Arter som ingår i Burkohlderia cepacia-komplexet kan inte
särskiljas.
• och några andra
– Arter som inte finns i databasen kan inte identifieras
Två nya MS-system från Bruker
Hårdvara:
MALDI-TOF:
Microflex
Mjukvara:
MALDI Biotyper
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
MALDI-TOF-TOF:
UltrafleXtreme
Artidentifiering av mikroorganismer
Exempel på långsamma metoder
Dagar
Kortjäsning (KJ)
Kortjäsning OL (KJOL)
Långjäsning (LJ)
Shigellajäsning (SHIGJ)
Yersiniajäsning (YERSJ)
API 20 C AUX (20CAUX)
API svamp (ID32C)
API 20E (20E)
API CORYNE (CORYNE)
API NE (NE)
API STREP (20STRE)
API NH (NH)
Pseudplatta (PSE)
Tweenplatta (TW80)
XVplatta (XV)
Tellurit (TEL)
Camptest (CAMP)
Omvänd camp (OMCAMP)
Rörkoagulas (COA)
Optochin (OPTO)
Rapidana (RAPID)
Deferoxamine (DEFER)
Salmonella fag (FAG)
VA CO KA GALLA (VCKGA)
1
1
1
1
1
>1
>1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
MALDI-TOF
MALDI-TOF är en snabb och
generell metod
Man behöver inte välja vilken
metod som ska användas
2 min – 2 tim
Artidentifikation
Fram till nu
• Biokemiska
tester
I framtiden
• MALDI-TOF
• Nukleinsyraanalys
• Antigenpåvisning
•
Antigenpåvisning
•
Biokemiska tester
• Nukleinsyraanalys
•
MALDI-TOF
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Snabb artidentifiering av positiva blododlingar
med MALDI-TOF
Två olika sätt
antingen
– att odla ut på platta och plocka kolonier så fort de är
synliga
eller
– att använda ett förprotokoll som tvättar bort
blodprodukterna från bakterierna i provet
och sedan använda standardprotokollet för MALDI
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
>5h
<1h
Snabb artidentifiering av positiva blododlingar
med MALDI-TOF
Schubert et al.,
ECCMID 2010
Total tid för isolering av bakterier: ~5 min!
Prestanda: >80% korrekt ID
inga falskt-positiva ID
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Kombinera snabb artidentifiering med
MALDI-TOF med resistensbestämning
med
Phoenix eller Vitek 2
Phoenix (BD)
MALDI-TOF,
Bruker
Vitek 2 (Biomerieux)
Identifiering av antibiotikaresistenta
bakterier
Ampicillin-resistenta E. coli
Toppen m/z 29,000 är β-lactamase
• Analysera skillnader i massprofiler
• Detektion av resistensmarkörer
• Funktionell MALDI-assay där
produkter from resistensenzymer
detekteras
Camara et al 2007
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
Bestämning av antibiotikaresistens för
Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL)
Funktionell MALDI-assay för detektion av hydrolyserat ampicillin
Sparbier et al JCM 2012
Identifiering av virulenta bakterier
Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC)
Påvisa
• Shiga-/verotoxiner
–stx1 och/eller stx2
• Virulensgener
–eaeA
–uidA (O157)
Stx2
Fagerqvist 2011
Samanfattning av MALDI-TOF
• Generell metod
• Identifierar de allra flesta kliniskt
relevanta bakterier och svampar
• Kan detektera mixade kolonier
• Minimal och enkel provberedning
• Enkelt köra instrumentet
• Snabb analys till låg kostnad
• Miljövinster
• Ny plattform för utveckling och forskning
Sabbare artbestämning med MALDI-TOF
kommer att sänka svarstiderna betydligt
Bo Nilson, Klinisk mikrobiologi
