Kvalitetssäkring och Validering
Molekylära Metoder
Susanna Falklind Jerkérus
Sektionen för Molekylär Diagnostik
Karolinska Universitetslaboratoriet
Vem/Vad styr oss?
• 98/79/EG - IVD direktivet
• Lagen (1993:584) om medicintekniska
produkter
•Socialstyrelsen
• SOSFS 2008:1
Socialstyrelsens föreskrifter om
användning av medicintekniska
produkter i hälso- och sjukvården
•Läkemedelsverket
• Läkemedelsverkets föreskrifter (LVFS
2001:7) om medicintekniska produkter
för in vitro diagnostik
•SWEDAC
• SWEDAC DOC 01:55
Validering/verifiering av kvantitativa och
kvalitativa metoder - Vägledning
• ISO 15189
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Socialstyrelsen - SOSFS
2008:1
5 kap. Egentillverkade medicintekniska produkter
Krav på egentillverkade medicintekniska produkter
1 § Egentillverkade medicintekniska produkter ska i tillämpliga delar
uppfylla de krav som ställs på CE-märkta medicintekniska produkter i
1. lagen (1993:584) om medicintekniska produkter,
2. Läkemedelsverkets föreskrifter (LVFS 2003:11) om medicintekniska
produkter,
3. Läkemedelsverkets föreskrifter (LVFS 2001:7) om medicintekniska
produkter för in vitro diagnostik
4 § Vårdgivaren ska ansvara för att det inte ställs lägre krav på de egentillverkade
medicintekniska produkternas säkerhet och medicinska
ändamålsenlighet än på CE-märkta produkter.
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Läkemedelsverket - LVFS 2001:7
• Analytisk och diagnostisk sensitivitet
• Analytisk och diagnostisk specificitet
• Noggrannhet och mätosäkerhet
• Reproducerbarhet
• Repeterbarhet och precision
• Spårbarhet genom kända referensmetoder och referensmaterial
• Livslängd och stabilitet (transport och lagring)
• Bruksanvisning på svenska
• Genomförande av riskanalys
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
SWEDAC - ISO 15189 - DOC 01:55 Vägledning
Validering
Fastställer att metoden mäter det man har för
avsikt att mäta
Verifiering
Bekräftar att metoden uppför sig på ett specificerat
sätt.
Om en metod är väldokumenterad t ex. genom publikation i
facktidskrift kan valideringen styrkas med en Verifiering.
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Metodens ursprung påverkar omfattningen av
valideringen.
Alternativ 1
Metod som är utvecklad och validerad för ett speciellt instrument
Leverantörens validering kan accepteras efter bedömning av leverantörens bifogade dokumentation. Även ett annat
laboratoriums validering kan accepteras, efter bedömning av valideringsprotokollet.
Alternativ 2
Metod som anpassas till ett instrument och som avser vedertagen metod där flera än en leverantör alternativt egna
program/moment/komponenter förekommer.
Om validerade komponenter från flera leverantörer används åligger det laboratoriet att verifiera att specificerade krav i
metoden uppfylls i sin helhet. Om komponenter inte är validerade ska laboratoriet genomföra en tillräckligt omfattande
validering.
Alternativ 3
Tillämpning av en metod publicerad i vetenskaplig litteratur eller modifiering av tidigare ackrediterad metod.
I detta fall måste valideringen/verifieringen vanligen ges en större omfattning än i fall 1 och 2. I de fall där metoden är allmänt
etablerad inom professionen kan validering/verifiering ges en mindre omfattning (motsvarande den för Alternativ 1).
Alternativ 4
Egenutvecklad metod.
För egenutvecklade metoder krävs en utförlig validering.
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Analytisk Sensitivitet och Specificitet
Analytisk Sensitivitet
Den minsta mängd målDNA/RNA som metoden
korrekt kan detektera =
detektionsgräns
Bakterier: Viable count, Virus: referensmaterial, paneler
Analytisk Specificitet
Primer/probsekvens, annealingtemp, korsreaktivitet
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Metodens förmåga att
bestämma enbart mål
DNA/RNA, och identifiera
sant negativa prov
Klinisk Sensitivitet och Specificitet
Klinisk Sensitivitet
Klinisk Specificitet
Andelen sanna
sjukdomsfall som påvisas
med metoden
Andelen friska som får
negativt testresultat med
metoden
Referensmetod/jämförelsemetod där fynden korreleras till sjukdom/friskhet
Molekylärbiologiska metoder ofta känsligare än referensmetoden vilket ger lägre
specificitet, konfirmera m sekvensering eller annan metod.
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Analytisk vs Klinisk Specificitet
100% Analytisk Specificitet ≠ 100% Klinisk Specificitet
• Friskt bärarskap (ingen sjukdom = falskt positiv)
• Utsöndrat DNA/RNA efter behandling
• Kontaminant
• Bifynd
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Positivt Prediktivt Värde
Sannolikheten att ett positivt utfall i en metod är
sant positivt.
Positivt prediktivt värde = sant positivt/(sant positivt + falskt
positivt)
(sensitiviteten)(prevalensen) / ((sensitiviteten)(prevalensen) + (1specificiteten)(1-prevalensen))
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Negativt Prediktivt Värde
Sannolikheten att ett negativt utfall i en metod är
sant negativt.
Negativt prediktivt värde = sant negativt/(sant negativt +
falskt negativt)
(specificiteten)(1-prevalensen) / ((specificiteten)(1-prevalensen) + (1sensitiviteten)(prevalensen))
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Prevalensens betydelse
Sensitivitet 99,9%
Specificitet 99,8%
Prevalens 5%
PPV= (0.999)(0.05) / ((0.999)(0.05) + (1- 0.998)(1- 0.05))=96%
Prevalens 0.2%
PPV=50%
Lika många sant positiva som falskt positiva
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Repeterbarhet Reproducerbarhet
Robusthet
Repeterbarhet %CV
Reproducerbarheten
%CV
Robusthet
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Alla faktorer hålls
konstanta
En eller flera faktorer
varieras
Lotberoende,
personberoende osv
Kontroller
Interna kontroller
Driftkontroll
Positiv PCR-kontroll
Internkontroll /Inhibitionskontroll /extraktionskontroll
Negativa kontroller , drift o PCR
Standardkurva
Externa kontroller
Paneler
Flerlabsjämförelser
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Driftkontroller
Driftkontroll standardavvikelser HSV 1 blåsor, 2012
30
Ct-värde
HSV 1
+3 SD
28
-3 SD
+ 2SD
-2 SD
26
Datum
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Driftkontroll standardavvikelser Parotit, 2011
32
CP-värde
30
28
Agens
26
+3 SD
24
22
+ 2SD
20
-2 SD
-3 SD
Datum
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
PCR kontroll standardavvikelser HSV 1 blåsor, 2010
38
36
Ct-värde
34
HSV 1
+3 SD
-3 SD
+ 2SD
-2 SD
32
30
28
26
24
22
20
Datum
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Internkontroll
Negativt prov
Internkontroll måste vara positiv för godkänd analys
Positivt prov
Internkontroll kan vara positiv eller negativ, pga
kompetition
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
Mutationer?
Håll koll på amplifieringsplottarna
Håll koll på statistiken
Håll koll på sekvenser i GenBank
Håll koll på omvärlden
Kvalitetspaneler
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
TACK!
Validering och Kvalitetssäkring Molekylära Metoder
